無菌車間又叫無菌室，它的要求更高，除了按潔凈室要求處理空氣中微粒外，還需要對室內空氣進行處理，即同時要去除生物污染源，對室檢查還需要對室內空氣采樣培養，以杜絕感染源。醫院手術室、血液透析室、藥品及三類一次性醫療用品生產都要求使用無菌室；但是檢測時需要檢測浮游菌、沉降菌等菌落數。
無菌定義是要求沒有活體微生物的存在，為了達到無菌車間內沒有活體微生物，無菌車間在產品制造過程中需要采取各種方法來去除制品中原有的微生物和防止制品受到微生物的污染。那么，在無菌車間中，使空間內達到無菌要求，就是室內環境控制的重點。控制微生物的生長、殺滅或去除微生物的方法通常有兩種，一種為化學類，另一種為物理類。其中，化學方法有化學劑、氣化雙氧水、臭氧和環氧乙烷等；物理方法有濕熱或干熱、輻射和過濾等。
無塵無菌車間一般是在微生物實驗室內專辟一個小房間。可以用板材和玻璃建造。面積不宜過大，約4 ~5 平方米即可，高2.5 米左右。無菌室外要設一個緩沖間，緩沖間的門和無菌室的門不要朝向同一方向，以免氣流帶進雜菌。無塵無菌車間和緩沖間都必須密閉。室內裝備的換氣設備必須有空氣過濾裝置。
承接食品廠無菌車間工程，對超高溫有蒸煮味的物料可采用高溫短時，此種方法可較好保持產品的營養、風味，其典型應用是對牛乳制品的以及部份蔬菜制品。物料的冷方法是指根據不同場合各種劑或紫外線、輻射、微波照射等以達到目的。
